PrimerCat

PRIMERCAT · 证据与验证说明

如何判断结果的可信度

摘要

PrimerCat 不为所有结果提供一个统一的“准确率”。我们把输入质量、算法输出、数据库覆盖、启发式假设和实验确认分别说明，帮助研究者判断当前证据能支持什么结论。

证据框架 1.6更新：2026-09-03研究用途
01

证据分级

不同类型的输出不能放在同一把尺子上评价。下列分级描述证据来源，而不是给结果打“可信度百分比”。

等级证据类型典型输出正确解释
C1确定性计算序列长度、GC%、坐标、配方换算、Primer3 返回参数在相同输入、参数和软件版本下应可复现；仍可能受输入错误或模型假设影响。
D1数据库依赖筛查RefSeq 模板、BLAST/Bowtie2 命中、accession只对结果标注的数据库/参考组装、检索日期、阈值和 hit 上限成立。
H1启发式排序qPCR 综合分、gRNA 活性分、Low/Medium/High 标签用于候选间排序；没有校准为概率，也不能跨工具或跨实验直接比较。
R1人工整理参考Protocol、配方说明、化学品危险摘要用于准备与核对，不替代原始论文、产品说明、SDS、SOP 或风险评估。
X0实验确认效率、单一产物、真实编辑率、真实脱靶、样本适用性PrimerCat 不产生这类证据；研究者必须在自己的实验体系中建立。

三个概念必须分开

计算完成

算法已返回数值或候选。

筛查通过

在特定数据库、阈值和返回范围内未触发警示。

实验有效

在目标样本、试剂、设备和对照下获得符合预设标准的结果。

02

各工具可支持的结论

PrimerCat 在下表中分别说明每个模块能支持的判断，以及研究者不能从结果继续推导的结论。

模块可以据此判断不能据此断言证据
qPCR 引物候选满足当前 Primer3 约束；人类与小鼠模式分别在固定的 GRCh38.p14 或 GRCm39 基因组及配套 RefSeq RNA 上模拟成对扩增，并区分所选转录本、同基因异构体与其他基因产物。扩增效率合格、单一熔解峰、样本中没有未注释转录本或变异影响，或实验必然成功。C1 + D1 + H1
常规 PCR候选在提交模板上的坐标、产物长度、结构参数；可选 BLAST 返回集中可形成的配对记录。全基因组唯一、目标样本一定有单条带、退火温度无需优化。C1 + D1
CRISPR gRNAPAM/链/位置；序列特征优先级；当前后端发现的近似位点。真实 on-target 编辑率、细胞内无脱靶、适用于任何 Cas 变体/递送系统。C1 + D1 + H1
BLAST选定数据库和参数下的局部相似命中及其统计量。功能相同、同源关系成立、物种鉴定完成或未命中即不存在。D1
溶液/Protocol/安全按给定数值计算用量；查阅结构化参考与来源链接。配方适配所有实验、网页摘要等同 SOP/SDS、危险分类适用于所有浓度和混合物。C1 或 R1

固定参考版本为人类 GRCh38.p14 / RefSeq 2025-08 注释和小鼠 GRCm39 / RefSeq 2024-02 注释；页面结果中的组装标签用于限定结论范围。13,14,16,17

影响结果的主要变量

  • 输入序列、转录本与基因组版本
  • 物种过滤与数据库更新状态
  • 阈值、返回 hit 数和超时/回退后端
  • 聚合酶、缓冲液、模板质量与样本变异
  • 细胞类型、染色质、Cas 变体与递送方式

算法与数据库组件已有同行评议文献，但具体网站组合流程的可信度仍取决于实现细节和验证数据。2,3,4,5,8,9

03

状态标签如何解释

PrimerCat 的状态标签只总结当前筛查；研究者不能把“没有发现证据”直接解释为“安全”或“特异”。

状态页面实际表达下一步
通过 / Low当前后端返回集中没有达到警示规则的额外命中。继续查看数据库范围、hit 上限和 on-target 识别方式；仍需实验确认。
复核 / Medium存在中等相似的额外命中，或证据不足以直接排除。比较候选、检查基因区域与错配位置，必要时使用更完整的专用工具。
高风险 / High发现额外完美/高相似命中、较多候选命中，或给定目标坐标未被锚定。通常优先更换候选；若必须使用，先完成针对性计算与实验验证。
无命中 / no hits该后端没有返回通过过滤条件的命中。检查查询是否正确、数据库是否覆盖目标，以及短序列搜索是否受限；不能视为“唯一”。
未检查 / error / skipped筛查未运行、超时或服务不可用。不得授予特异性或低风险结论；重试或改用独立工具。
04

建议的实验验证路径

我们只提供最低限度的验证方向，而不是统一 SOP。研究者应根据自己的实验体系预先定义接受标准。

RT-qPCR / qPCR

  1. 确认 accession、目标异构体与扩增子序列；必要时检查常见变异位点。
  2. 设置 NTC 与 no-RT 对照；验证单一产物（熔解曲线和/或凝胶）。
  3. 用标准曲线评估扩增效率、线性范围与检测限；报告引物序列、浓度、反应条件和原始数据。
  4. 表达定量使用经验证的参考基因与适当归一化，并遵循 MIQE 2.0。

常规 PCR

  1. 先做退火温度梯度，并同时设置阳性、阴性和无模板对照。
  2. 用凝胶确认产物数量与大小；关键应用用 Sanger 或其他方法确认序列。
  3. 针对真实样本来源检查基因组版本、变异和模板复杂度。

CRISPR

  1. 使用独立、基因组感知的设计工具复核候选，并优先提供明确的目标基因座。
  2. 在目标细胞中用 amplicon sequencing 或等效方法测量 on-target 编辑和 indel 谱。
  3. 按应用风险选择预测位点测序或 GUIDE-seq 等无偏方法；计算筛查不能替代细胞内脱靶测量。

BLAST 与参考资料

  1. 以 accession 与原始记录复核关键结论，必要时使用多序列比对、结构域和系统发育分析。
  2. Protocol 与配方回到原始来源和本机构 SOP；化学品操作核对当前瓶身、供应商 SDS 与 EHS 要求。
05

复现与变更因素

研究者若要让他人重建一次结果，应同时保存计算上下文，而不只是复制一条候选序列。

必须记录原因
原始输入或 accession + version数据库 accession 更新后序列可能改变。
物种与参考组装同一序列在不同组装中的命中和坐标不同。
全部设计参数预设只是初值，实际提交值决定候选。
筛查后端、数据库和日期本地 Bowtie2 与 NCBI BLAST 的覆盖范围不同，远程数据库持续更新。
返回上限与异常状态hit 截断、超时或回退会改变可见证据。
PrimerCat/依赖版本Primer3、Biopython、索引和评分规则变更可能改变输出。
06

当前运行依据与核验记录

为使 PrimerCat 的结果可追溯，我们在这里固定公开当前服务采用的参考版本、索引规模、软件质量基线和线上抽查结果。研究者应在标注的数据范围、规则与检查日期内解释每项结论。

人类注释特征记录

4,514,782

人类转录本定位记录

202,461

小鼠注释特征记录

3,023,953

人类参考数据

GRCh38.p14 / GCF_000001405.40; GCF_000001405.40-RS_2025_08

检查结果
清单所列运行文件 17/17 通过构建端与生产端 SHA-256 比对。
结论边界
确认清单所列文件在两端一致，并限定人类基因组与 accessioned RefSeq RNA 的计算范围。

小鼠参考数据

GRCm39 / GCF_000001635.27; GCF_000001635.27-RS_2024_02

检查结果
本次更新涉及的文件 3/3 通过构建端与生产端 SHA-256 比对。
结论边界
确认本次变更涉及的三项文件一致；不表示对全部小鼠运行文件完成同范围校验。

软件质量基线

Git 0f42ebe

检查结果
283 项后端测试通过；Next.js 生产构建通过。
结论边界
证明该基线满足已编码的测试约束，不证明候选的生物学表现。

线上可用性抽查

8 条公开路由；qPCR / PCR / CRISPR / BLAST

检查结果
2026-09-03 完成生产环境冒烟测试。
结论边界
证明抽查时页面可访问且四条主流程可完成；不是持续可用性承诺或实验验证。

NCBI 人类组装人类注释版本NCBI 小鼠组装审计基线代码文件校验清单证据快照（JSON） ↓

这里的“通过”只表示相应软件或数据检查在记录时完成：数据库行数不是独立基因或可用候选数量，计算审计不是湿实验成功率，自动化测试和线上冒烟测试也不构成生物学或临床验证。13,14,16,17

07

固定参考计算覆盖审计 v0.6

我们从固定版小鼠 RefSeq RNA 按公开、确定性的散列规则选取 200 个不同基因，每个基因保留一个 NM_ 转录本，再由 PrimerCat 重新生成并筛查候选。这项审计扩大了流程覆盖面，但不是随机抽样、外部准确率测试或湿实验验证。2,4,9,11,12,13,14,15

候选对已筛查

2000

联合计算通过

1648/2000

基因至少一对通过

180/200

本轮如何运行

抽样框限于固定 RNA FASTA 中具有 GTF 基因座、长度 250–5,000 bp 且只含 A/C/G/T 的 NM_ 转录本。按 SHA-256(seed:accession) 排序，每个基因保留第一个转录本，再取前 200 个基因。每条记录以 Primer3 生成并保留 penalty 最低的 10 对候选，随后在 GRCm39 基因组和配套 RefSeq RNA 上执行同一套成对扩增规则。联合通过要求所选转录本恰有 1 个产物、没有其他基因或未分类转录本产物，且基因组结果兼容；同基因异构体另行报告。

指标判定规则结果正确解释
候选对已筛查200 个不同基因各取 Primer3 penalty 最低的候选2000所有候选使用同一参考组装、参数和判定规则。
所选转录本产物所选 accession 上恰有 1 个 50–5000 bp 成对产物1992/2000确认固定 RNA 集合中的预期产物，不代表样本实际表达。
转录本基因层面通过目标产物存在，且没有其他基因或未分类转录本产物1749/2000允许同基因其他异构体共同扩增。
异构体特异标志基因层面通过，且未见同基因其他异构体产物302/2000只对当前固定 RefSeq 注释成立。
同基因其他异构体至少一个其他 RefSeq 异构体可形成产物1577/2000不影响基因总表达用途，但不支持单一异构体结论。
其他基因产物至少一个其他基因的 RefSeq 转录本可形成产物215/2000联合规则不通过，建议更换候选。
联合计算通过转录本基因层面通过，且基因组结果兼容1648/2000计算筛查通过，不是实验成功率。
转录组证据补足无连续基因组产物，但确认目标 RNA 且未见跨基因产物320/2000合理识别跨剪接候选，而非把“无基因组产物”直接当成唯一性。
转录本命中截断任一端超过 128 个转录本判定命中39/2000可能遗漏额外产物，按保守规则不通过。
基因至少一对通过该基因的候选中至少一对满足联合规则180/200说明候选集中有计算上更优选项，不代表该基因实验成功率。

下载基准快照 ↓查看 100 基因 PrimerBank 外部对照 v0.5

页面中的比例只描述固定组装、固定 RNA 集合、当前软件版本和预设规则下的计算结果。它不是准确率、灵敏度、临床性能或实验成功率；散列抽样保证可复现，但不能使该队列代表基因表达丰度、人群、组织或真实实验分布。

为避免混淆两类证据，v0.5 的 100 个 PrimerBank 基因外部对照继续单独保留。PrimerBank 的实验记录只验证其公开引物，不验证 PrimerCat 新生成的候选。 v0.5 报告 864/1000 对联合计算通过，94/100 个基因至少有一对通过。

NEXT

下一层证据

在引物结合位点增加固定版本常见变异检查，并从联合通过、跨基因产物、同基因多异构体和无连续基因组产物等类别中预先抽样，依据效率、线性、单一产物、NTC 与 no-RT 标准开展前瞻性湿实验。

08

当前验证状态

我们主动公开 PrimerCat 尚未建立的证据，避免研究者把软件可用性误解为学术验证。

01

我们已公开逐候选计算记录

v0.6 从固定 RefSeq RNA 中确定性选取 200 个不同基因；我们同时公开抽样规则、参考文件校验值、运行参数、逐候选筛查记录和代码校验值。

02

PrimerCat 尚无临床验证

PrimerCat 仅用于研究设计，不用于诊断、治疗决策、临床报告或监管提交。

03

算法组件有同行评议依据

Primer3、BLAST、Bowtie2、RefSeq、MIQE 与 CRISPR 研究为组件和验证框架提供依据，但不等于对 PrimerCat 整体性能的背书。

04

仍未覆盖样本变异与实验体系

固定 RefSeq RNA 能区分已注释异构体，但不代表样本实际表达谱，也不覆盖未注释转录本、样本 SNP/结构变异、试剂体系或实际扩增行为。命中达到上限的候选按不确定处理。

化学安全条目采用 PubChem 等代表性来源，但真实操作必须回到当前产品 SDS；聚合数据库的存在不构成针对具体产品的安全保证。10

REF

参考文献

参考文献覆盖算法基础、数据库、qPCR 报告规范、PrimerBank 公开对照与 CRISPR 实验脱靶验证。

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判读原则

把“可信”变成可检查的记录

研究者应先确认输入与筛查后端，再阅读命中详情，最后在实际实验体系中完成验证。