高保真 PCR
从反应设计、主混合液到扩增后验证的基础工作流。参数以 Phusion 为示例，实际设置必须跟随所用酶说明书。
- 文件编号
- PC-PRO-001
- 版本
- 1.0
- 内容复核
- 2026-08-31
- 文件属性
- 研究参考流程
操作程序0% 完成
01适用范围与排除项
适用于使用 NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 的常规 DNA 扩增参考。若使用其他聚合酶、热启动体系、长片段、GC-rich 模板或临床/诊断样本，必须采用相应产品说明书和本机构验证流程。
02关键参数与适用条件
| 参数 | 参考值 | 适用说明 |
|---|---|---|
| 反应体积 | 20 µL 或 50 µL | NEB Phusion 示例体系；缩放时保持各组分终浓度。 |
| 引物终浓度 | 各 0.5 µM | 对应 10 µM 引物在 20 µL 体系中各加 1 µL。 |
| dNTP 终浓度 | 各 200 µM | 以 10 mM dNTP mix 为例，20 µL 体系加入 0.4 µL。 |
| 循环框架 | 98°C 30 s；25–35 cycles | 变性 98°C 5–10 s；退火由 NEB Tm Calculator 确定；72°C 延伸 15–30 s/kb。仅适用于所引 Phusion 条件。 |
03必要对照
- 01无模板对照（NTC）：监测主混合液、环境或移液过程污染。
- 02阳性扩增对照：在新引物、新模板类型或排错时确认反应体系有效。
- 03必要时设置提取空白或逆转录阴性对照，控制上游步骤引入的信号。
04试剂、耗材与设备
- 高保真聚合酶、配套缓冲液与 dNTP
- 正向/反向引物、模板 DNA 与无核酸酶水
- PCR 管、冰盒、移液器与热循环仪
- 无模板对照；需要时加入阳性对照
05操作程序
确认反应体系
打开当前聚合酶的产品说明书，记录缓冲液倍数、推荐引物浓度、模板范围、退火温度算法和延伸速率。不要把不同酶的参数混用。
规划对照与孔位
至少设置无模板对照，并在需要判断体系是否工作的场景加入阳性对照。先建立加样表，再标记所有反应管。
配制主混合液
在冰上解冻并轻柔混匀组分。按反应数外加合理移液余量配制不含模板的主混合液；聚合酶按说明书要求最后加入。
分装并加入模板
将主混合液分装到各管，在独立区域加入模板和对照，换枪头避免交叉污染；短暂离心收集液体。
运行热循环
Phusion 的常规参考是 98°C 初始变性，25–35 个循环，并按 NEB Tm 工具确定退火温度、按片段复杂度设置 15–30 秒/kb 延伸；其他酶必须使用各自参数。
验证并记录
结合扩增目的选择琼脂糖凝胶、片段分析或下游纯化。先检查对照，再解释样本；记录程序、模板量、引物批次和异常。
06验收标准
- NTC 在目标片段区域无可见扩增；阳性对照产生预期大小条带。
- 样本主条带与预期片段大小一致，且非特异条带/拖尾在下游用途允许范围内。
- 所有偏离预设程序、试剂替换和重复实验均被记录。
07必须记录
- 模板 ID、类型、输入量与保存位置
- 引物序列/批次、工作液浓度与目标片段长度
- 聚合酶货号/批次、反应配方、热循环程序与凝胶原图
关键边界
本卡的温度和时间只对应所引 Phusion 示例。不同聚合酶、模板 GC 含量与扩增长度会改变最优条件。
安全提醒
扩增产物区与反应配制区分开；凝胶染料、UV/蓝光成像和含样废物按本实验室 SDS、SOP 与分区制度处理。